本课题拟应用双层细胞培养板(Transwell)以肠上皮细胞Caco-2与巨噬细胞RAW264.7共培养作为体外实 验模型,分析植物来源的多不饱和共轭脂肪酸-石榴酸对其炎性反应的影响;应用荧光定量PCR、免疫荧 光细胞化学技术、蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附实验、PPARγ特异性抑制实验及基因敲减技术分析PPAR γ表达变化特点,明确PPARγ在此过程中的关键作用;应用基因过表达技术,结合蛋白免疫印迹和荧光 定量PCR等技术,分析NF-κB活化状态及抑制因子IκB和协同活化因子CBP和p300的表达变化,在此基础 上进一步结合PPARγ抑制实验,解析石榴酸通过PPARγ/NF-κB途径发挥作用的分子机制;进一步通过小 鼠动物模型分析肠黏膜组织学变化、分泌型IgA(sIgA)及炎性相关细胞因子表达变化;应用免疫组织化 学法计数肠上皮内淋巴细胞(IEL),并分析固有层巨噬细胞表达水平变化,明确体内实验中石榴酸对小 鼠肠黏膜免疫功能的影响。同时应用免疫组织化学及荧光定量PCR技术分析PPARγ/NF-κB的活化状态; 荧光定量PCR和气相色谱技术分析肠黏膜组织多不饱和脂肪酸的种类和含量及其代谢合成相关酶表达谱的 变化,从多个层面解析石榴酸通过对PPARγ/NF-κB途径的影响,调节肠黏膜免疫状态的分子机制。本项 目的成功实施,将开拓石榴酸对肠道功能影响的认识,为进一步研究提供新的思路。